細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法眾多，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點(diǎn)――可以準(zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。因此，具有其它方法*的*性。下面我們就簡(jiǎn)單明了地介紹流式在檢測(cè)凋亡方面的應(yīng)用。
在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下，首先是細(xì)胞色素C和apa f-1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退;后是caspase家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時(shí)細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細(xì)胞變小，胞核皺縮;zui后是細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，形成凋亡小體。
在凋亡發(fā)生的各個(gè)過(guò)程當(dāng)中，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測(cè)方法，可以采用以下檢測(cè)方法：
1、線粒體功能
2、DNA Cycle
3、Caspases
4、Annexin V Assay
5、DNA Fragmentation Assays
基本上涵蓋了細(xì)胞凋亡的各個(gè)期，對(duì)各種檢測(cè)方法的原理和特點(diǎn)做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹。
線粒體功能檢測(cè)的試劑盒有深圳達(dá)科為公司代理的試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)為BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測(cè)主要采用陽(yáng)離子型熒光染料。原理是：正常細(xì)胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光;而細(xì)胞凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無(wú)法進(jìn)入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光?？梢栽跓晒怙@微鏡下，或流式檢測(cè)。采用488nm激發(fā)，其檢測(cè)波長(zhǎng)分別是527nm和590nm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，只需要30min就可以見(jiàn)到結(jié)果。
Caspase家族可以檢測(cè)的分子非常多，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應(yīng)用。即使沒(méi)有相應(yīng)的試劑盒，只要有相應(yīng)抗體基本上是可以檢測(cè)的，具體的方法是參照細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測(cè)的步驟。
在細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴隨著一系列的形態(tài)特征改變，細(xì)胞膜的改變是這些特征中較早出現(xiàn)的一種。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)。Annexin-V是一種35-36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，它對(duì)PS具有較高的親和力。細(xì)胞凋亡時(shí)，可以和外翻的PS結(jié)合，從而可以檢測(cè)凋亡的細(xì)胞。發(fā)生死亡的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的PS也外翻，因而也會(huì)陽(yáng)性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標(biāo)記之外，還會(huì)加一種DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的細(xì)胞膜通透性增高，染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和DNA結(jié)合，從而可以發(fā)熒光，區(qū)分出死細(xì)胞。
下圖給出的是在使用FAS單抗誘導(dǎo)前后的檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC, 縱坐標(biāo)是PI，左上、右上、左下、右下四個(gè)象限中右上象限代表死亡的細(xì)胞，左下象限是存活的細(xì)胞，右下象限是凋亡的細(xì)胞。
在采用Annixin V方法檢測(cè)凋亡細(xì)胞時(shí)，要特別強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)：該方法適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較高的假陽(yáng)性，從而影響檢測(cè)結(jié)果。盡管目前，包括國(guó)外也有一些單位采用該方法檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測(cè)。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)非常小心。
DNA周期檢測(cè)原本是用來(lái)反應(yīng)細(xì)胞各個(gè)期，即細(xì)胞增殖狀況的。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測(cè)的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍，而S期介于兩者之間。
但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少，因而可以在細(xì)胞G0-G1期前面有一個(gè)亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。但是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時(shí)，現(xiàn)在看來(lái)，那時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測(cè)資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0-G1期峰的一個(gè)峰，死亡的細(xì)胞峰離G0-G1期峰較遠(yuǎn)，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得。有其它的替代方法，*可以不用這種方法。
晚期凋亡的細(xì)胞由于DNA的斷裂，因而可以出現(xiàn)DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測(cè)方法TUNEl。流式也能進(jìn)行Tunel檢測(cè)，其檢測(cè)原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致。以BD公司的為例，其利用TdT能將熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。但是由于在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，細(xì)胞需要進(jìn)行固定處理，操作類似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽(yáng)性。建議采用原裝大廠的試劑盒，并且嚴(yán)格的設(shè)立對(duì)照。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后再進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本處理后，均可以用熒光纖維鏡進(jìn)行觀察，拍照。流式檢測(cè)后，可以進(jìn)行的計(jì)算凋亡百分比。這一點(diǎn)，經(jīng)典TUNEl是做不到的。